| |
Возможности прогнозирования инсулинзависимого сахарного диабета в семьях больных на основе исследования генетических маркеров
Т.Л. Кураева, В.А. Петеркова, *В.В. Носиков, *А.С. Сергеев, И.И. Дедов
|
Эндокринологический научный центр
(дир.-акад. РАМН И.И.Дедов), Москва
*Государственный научный центр “Гос НИИ Генетика”
(дир. - член-корр. РАН В.Г. Дебабов), Москва
В основе ИЗСД лежит абсолютная инсулиновая недостаточность, развивающаяся в результате аутоиммунного разрушения островковых b-клеток у генетически предрасположенных индивидуумов. В настоящее время ИЗСД рассматривается как многофакторное заболевание, причинами развития которого являются как факторы внешней среды, так и генетическая предрасположенность.
В геноме человека были идентифицированы два локуса, связанные с предрасположенностью к развитию ИЗСД: локус HLA, расположенный на хромосоме 6р21.3, и область, расположенная на хромосоме 11р 15.5, в которую входит ген инсулина. Эти два локуса получили обозначения IDDM1 и IDDM2 соответственно, и они определяют около 40% от общего генетического риска развития ИЗСД [2].
Хорошо известна связь ИЗСД с DR, DP и DQ-антигенами системы HLA. В последние годы обнаружена ассоциация этого заболевания с различными аллелями генов HLA-DQА1/В1. Предпринимаются попытки прогнозирования развития сахарного диабета на основании комплексных иммунологических, иммуногенетических и гормональных исследований. Однако значение генетических факторов в повышении прогностической ценности этих исследований пока изучено недостаточно. Кроме того, принимая во внимание популяционные различия в частоте встречаемости антигенов HLA-системы, оценка риска должна быть уточнена для каждой популяции. Для русской популяции эти исследования проведены впервые.
Целью настоящей работы было изучение возможности генетического прогнозирования ИЗСД в семьях русской популяции на основе исследования генетических маркеров, ассоциирующихся с сахарным диабетом.
Определение HLA-антигенов классов I, II (A, B и DR) и полиморфных аллелей генов HLA-DQ проведено у 480 человек русской национальности: больных случайной выборки (145 человек), здоровых (121 человек) и в 26 ядерных семьях, конкордантных по ИЗСД, с двумя и более больными сибсами, и в 20 семьях с дискордантными по ИЗСД сибсами. Возраст больных колебался от 2 до 43 лет. Возраст манифестации диабета был от 1 года до 32 лет.
Для выявления антигенов HLA - А, В и DR использовались сыворотки из коллекции Санкт-Петербургского НИИ гематологии и переливания крови МЗ РФ с включением коммерческих сывороток фирм “Boerhing” и “Pel-Freez” и сывороток из коллекции XI заседания международной Рабочей группы по гистосовместимости. Полная или обогащенная суспензия лимфоцитов получена методом, основанным на элиминации Е-розеткообразующих клеток с использованием эритроцитов барана, обработанных нейроаминидазой.
Типирование аллельных вариантов генов HLA DQA1 и DQB1 проводилось методом полимеразной цепной реакции с последующей гибридизацией фрагментов с олигонуклеотидными зондами, специфичными к определенным аллелям.
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью компьютерных программ, разработанных А.С. Сергеевым (Медико-генетический научный центр РАМН). Сравнение частот маркерных генов проводили с помощью t-критерия Стьюдента или по критерию Х. При малочисленных выборках использовался критерий Х с коррекцией Йетса на непрерывность выборки либо применялся “точный” метод Фишера для четырехпольных таблиц. Относительный риск (RR) рассчитывали по формуле:
(а+0,5) (d+0,5)
RR=————————————————————————,
(b+0,5) (c+0,5)
где a – число лиц с наличием и b– с отсутствием данного маркера среди больных; c и d – число лиц с наличием и отсутствием соответственно данного маркера среди здоровых, параметр 0,5 использовался как поправка на малочисленность выборки.
Абсолютный риск, т.е. условную вероятность развития заболевания у лиц, носителей данного генетического маркера или их комбинаций, рассчитывали по методу Байеса:
ОР (Gi/D)(P/D)
Ar (D/Gi)=——————————————————————————————————,
P(Gi/D)P(D)+[1-P(D)] P(Gi/D)
где Ar (D/Gi) – вероятность развития заболевания, условная по носительству данного гена (генотипа), т.е. абсолютный риск;
ОР (Gi/D) – частота генотипа Gi по данным опыта;
P(Gi/D) – частота генотипа Gi у здоровых;
P(D) – риск развития заболевания в популяции (безусловный).
Анализ семейного материала по гаплоидентичности сибсов проводился методом пораженных сибсовых пар с использованием условно вероятностного подхода [1].
Повторный риск развития СД для пар сибсов в зависимости от их конкордантности по генетическим маркерам (гаплотипам) рассчитан на основании метода эмпирической оценки, разработанного Сергеевым А.С.
Метод основан на комбинаторном анализе распределения гаплотипов с помощью “конвертирующих” коэффициентов, с использованием условно-вероятностного подхода. При этом на основе данных по общему повторному риску (не дифференцированному по гаплотипам) проводится коррекция соотношения объемов выборок конкордантных и дискордантых по заболеванию семей.
При анализе полученных данных выявлены существенные отклонения в распределении HLA-антигенов при ИЗСД. Обнаружено статистически достоверное повышение частоты В16 (25,0% против 5,7%, p<0,01), DR4 (51,7% против 19,1%, p<0,01) и гетерозиготы DR3/DR4 (24,1% против 2%, p<0,01). Обнаружена также отчетливая тенденция к снижению DR2 у больных ИЗСД (0,7% против 35,6%).
Однако антигены DR3 и DR4 не являются сильными генетическими маркерами, поскольку более 50% здоровых людей имеют один или другой антиген или их комбинацию. В современной научной литературе имеются сообщения о том, что ассоциации с DR-антигенами могут быть вторичными по отношению к DQ-антигенам. Оказалось, что гены подлокуса HLA-DQ более тесно сцеплены с ИЗСД, чем гены DR. Кроме того, в отличие от других подлокусов гены DQA1 и DQB1 оказались полиморфными. У гена DQA1 было идентифицировано 8 аллелей, которые были условно разделены на 2 группы: кодирующие остаток аргинина в 52 положении (Аrg 52+) и некодирующие его в этом положении (Аrg 52-). У гена DQB1 идентифицировано 14 аллелей, которые условно могут быть разделены на аллели, содержащие остаток аспарагиновой кислоты в 57 положении (Аsp 57+) и не содержащие его (Аsp 57-).
Распределение носительства аллелей генов DQA1 и DQB1 у больных сахарным диабетом и в контрольной группе представлено в табл. 1, 2.
Таблица 1
Распределение носительства аллелей гена HLA-DQAI среди больных ИЗСД и здоровых индивидуумов
|
Аллели гена
HLA-DQAI |
Остаток Аrg в
положении 52 |
Больные
ИЗСД, % |
Контроль, % |
RR |
p |
|
DQA1*0101 |
- |
26 |
66 |
0,19 |
<0,001 |
|
DQA1*0201 |
- |
7 |
24 |
0,25 |
<0,001 |
|
DQA1*0301 |
+ |
86 |
32 |
12,34 |
<0,001 |
|
DQA1*0401 |
+ |
67 |
50 |
1,93 |
<0,002 |
Таблица 2
Распределение носительства аллелей гена HLA- DQB1 среди больных ИЗСД и здоровых индивидуумов
|
Аллели гена
HLA-DQAI |
Остаток Аrg в
положении 52 |
Больные
ИЗСД, % |
Контроль, % |
RR |
p |
|
DQВ1*0501 |
- |
17 |
24 |
- |
>0,5 |
|
DQВ1*0502 |
- |
2 |
2 |
- |
>0,5 |
|
DQВ1*0503 |
+ |
0 |
11 |
0,03 |
<0,001 |
|
DQВ1*0601 |
+ |
3 |
3 |
- |
>0,5 |
|
DQB1*0602 |
+ |
0 |
14 |
0,03 |
<0,001 |
|
DQB1*0603 |
+ |
0 |
20 |
0,02 |
<0,001 |
|
DQB1*0604 |
- |
4 |
6 |
- |
>0,5 |
|
DQB1*0201 |
- |
64 |
36 |
3,15 |
<0,001 |
|
DQB1*0301 |
+ |
17 |
36 |
0,37 |
<0,005 |
|
DQB1*0302 |
- |
71 |
17 |
11,40 |
<0,001 |
|
DQB1*0303 |
+ |
7 |
9 |
- |
>0,5 |
|
DQB1*04* |
+ |
4 |
7 |
- |
>0,5 |
У больных ИЗСД достоверно чаще встречались аллели DQA1*0301 и 0401, DQB1*0201 и 0302 и реже по сравнению с контрольной группой встречались аллели DQA1*0101 и 0201, DQB1*0503, *0602, *0603, *0301.
Полученные результаты позволяют условно обозначить аллели, кодирующие остатки Arg 52+ A- цепи и Asp 57-B-цепи, как предрасполагающие (S) к развитию ИЗСД, а аллели, кодирующие Arg 52- и Asp 57+, как протекторные (Р). Предрасполагающие аллели гена HLA- DQA1 обнаружены у 83% больных, а гена DQB1 – у 87%. Для здоровых эти величины равны соответственно 45 и 47%. Наибольший риск развития диабета имеют носители аллелей DQA1*0301 и DQB1*0302.
Существенно более надежные оценки риска могут быть получены, если в качестве маркеров рассматриваются не отдельные аллели генов HLA-DQA1 и DQB1, а их комбинации.
В табл. 3 представлена частота распределения всех возможных комбинаций у больных и в контрольной группе.
Таблица 3
Распределение комбинаций предрасполагающих (S) и
протекторных (P) аллелей HLA-DQ среди больных ИЗСД
и в контрольной группе
|
HLA-DQ
A/B |
Больные
ИЗСД, %
n=113 |
Контроль, %
n=121 |
RR |
p |
|
SS/SS |
52 |
4 |
23,12 |
<,001 |
|
SP/SS |
23 |
8 |
3,21 |
<,005 |
|
SS/SP |
16 |
12 |
0,1 |
<,1 |
|
SP/SP |
7 |
20 |
0,02 |
<,01 |
|
PP/SS |
1 |
7 |
|
|
|
SS/PP |
1 |
8 |
|
|
|
PP/SP |
0 |
17 |
0,02 |
<,001 |
|
SP/PP |
0 |
16 |
0,02 |
<,001 |
|
PP/PP |
0 |
8 |
0,04 |
<,001 |
Частота гаплотипа с 4 предрасполагающими аллелями (SS/SS) у больных СД составила 52% против 4% в контрольной группе (RR=23,1, p<0,001). Генотипы, состоящие из трех предрасполагающих и одного протекторного аллеля, можно разделить на две подгруппы. Когда гаплотип S-S представлен у гена DQB1, а S-Р – у DQA1, то соответствующие генотипы встречаются у больных достоверно чаще (RR=3,21, p<0,005), чем в случае ситуации S-S от DQA1 и S-Р от DQB1. Последние генотипы также представлены чаще среди больных, однако не достигают статистически значимых уровней. Можно предположить, что большое значение в развитии заболевания имеют аллели HLA- DQB1, кодирующие Asp 57. Среди больных снижена частота комбинаций из двух предрасполагающих и двух протекторных аллелей и не обнаружено индивидуумов с тремя и четырьмя протекторными аллелями, в то время как в контрольной группе частота таких комбинаций (RR=0,02-0,04, p<0,001) составляла 56% (рис. 1).
Рис. 1. Частота встречаемости генотипов DQA1/DQB1 в зависимости от количества предрасполагающих (S) и протективных (Р) аллелей у больных ИЗСД и здоровых индивидуумов.
Абсолютный риск развития ИЗСД у носителей четырех предрасполагающих аллелей составил 2,54%, что в 13 раз выше популяционного, рассчитанного нами для Москвы. Для носителей трех предрасполагающих аллелей риск составил 0,4%, а для всех остальных индивидуумов – 0,05% и ниже (рис. 2).
Рис. 2. Абсолютный риск развития ИЗСД в популяции в зависимости от комбинации предрасполагающих (S) и протекторных (Р) аллелей в HLA-DQ генотипе.
На рис. 3 представлена сравнительная характеристика исследованных генетических маркеров по показателю относительного риска развития СД. Наиболее слабым из всех значимых маркеров оказался DQB1*0201, далее по возрастающей следуют DR4, B16, DQB1*0302, DQA1*0301, DR3/DR4, SS/SS.
Рис. 3. Относительный риск развития ИЗСД в популяции в зависимости от генетического маркера.
Индивидуальные оценки риска развития ИЗСД у здоровых сибсов могут быть получены при исследовании степени их генетической общности с больным пробандом по генетическим маркерам, ассоциированным с ИЗСД.
Метод определения идентичности по гаплотипам, наследуемым от предков (IBD), позволяет проводить сравнение распределения пар сибсов, идентичных по 2, 1 или 0 маркерным гаплотипам. Для выполнения этих исследований потребовались семьи, сгруппированные в подгруппы в зависимости от числа больных индивидуумов. Первая подгруппа включала 26 семей, в которых имелось два или более сибсов, конкордантных по наличию ИЗСД. Вторая подгруппа – 20 семей, в которых имелись сибсы, дискордантные по ИЗСД с пробандом. В качестве генетической “метки” использовались А, В и DR-антигены системы HLA и аллели А- и В-цепи HLA-DQ. Сравнение полученных данных проводилось с ожидаемым случайным распределением 1:2:1 или 25:50:25. В первой подгруппе это соотношение составило 62,2:26,9:3,9. Отличие от случайного распределения было высоко достоверно (Х=27,8, p<0,001). Во второй подгруппе соотношение было 21,4:64,3:14,3, что существенно не отличается от случайного распределения 25:50:25 (p<0,05).
На основании проведенных исследований получена эмпирическая оценка повторного риска для сибсов в зависимости от идентичности их по гаплотипам. В случае идентичности здорового сибса с больным по двум гаплотипам риск развития заболевания у него составляет 17%, по одному гаплотипу – 3%, у гаплоразличных сибсов – 0,85%. При этом средний риск развития ИЗСД для сибсов без подразделения на гаплотипы принят на основании наших предыдущих исследований и составляет 6,4%.
Суммируя данные, полученные при генетическом типировании больных ИЗСД и при изучении гаплоидентичности сибсов, конкордантных и дискордантных по ИЗСД, можно выделить 3 группы генетического риска развития этого заболевания в семьях больных (табл. 4).
Таблица 4
Степень генетического риска в семьях больных ИЗСД в зависимости от комбинаций предрасполагающих (S) и
протекторных (Р) аллелей, носительства конкретных аллелей HLA-DQ-генов и гаплоидентичности cибсов
|
Группа риска |
Комбинации
S и P аллелей |
Носительство
конкр. аллелей
или HLA-аг |
Гаплоидентичность
сибсов |
|
Высокий |
SS/SS |
DQA1*0301,DQB1*0302
DR3,4 |
По 2
гаплотипам |
|
Средний |
SS/SP |
DQA1*0401,DQB1*0201
DR4, B16 |
По 1
гаплотипу |
|
Низкий |
SS/PP SP/PP
PP/PP |
Все остальные аллели
DR2 |
По 0
гаплотипов |
С увеличением объема исследований этот риск может быть оценен для родственников больных в цифровом выражении с учетом числа больных и здоровых родственников, возраста консультируемых и возраста манифестации ИЗСД. В дальнейшем могут быть получены суммированные оценки риска, учитывающие все исследуемые показатели.
Исследованные генетические маркеры являются лишь частью генов, определяющих предрасположенность к развитию ИЗСД. Изучение всей совокупности генетических маркеров, определяющих развитие этого заболевания, – задача ближайшего будущего в рамках исследований по Программе “Геном человека”.
Кратко резюмируя полученные данные, следует отметить, что у больных ИЗСД русской популяции Москвы имеет место существенное повышение частоты встречаемости антигенов HLA-В16 и DR4, гаплотипа DR3/DR4, а также аллелей генов HLA-DQA1*0301 и DQB1*0302. Относительный риск при этом составил соответственно 5,55; 4,53; 17,58; 12,34; 3,15. Аллели, кодирующие Arg52(+) в А-цепи и Asp57(–) в В-цепи, встречаются чаще среди больных ИЗСД по сравнению с контрольной группой, что говорит об их предрасполагающей роли в развитии ИЗСД. Аллели, кодирующие Arg52(–) и Asp57(+), встречаются реже при ИЗСД, что позволяет отнести их к протекторным. Риск развития ИЗСД зависит от комбинации предрасполагающих и протекторных аллелей в генотипе. Для лиц с наличием 4 предрасполагающих аллелей абсолютный риск составил 2,54%, что примерно в 13 раз превышает популяционный риск развития заболевания. Для лиц, носителей трех предрасполагающих и одного протекторного аллелей, риск составил 0,4%. Для всех остальных комбинаций риск был существенно ниже популяционного. Среди пар сибсов, больных ИЗСД, отмечено достоверное увеличение частоты идентичности по двум HLA-гаплотипам. У сибсов, дискордантных по ИЗСД (один сибс болен, второй здоров), распределение их по степени HLA-идентичности не отличалось от случайного. Риск развития ИЗСД для сибсов, идентичных с больным по двум HLA-гаплотипам, составил 17%, по одному гаплотипу – 3%, полностью различных – 0,85%.
Литература
1. Сергеев А.С.//Генетика. – 1991. – Том 27. - № 11. – С.2021-2034.
2. Bennett S., Todd J.//Diabetes Rev. Intern. – 1996. – Vol. 5. - № 2. – P.2-6
3. Joslin’s Diabetes Mellitus//Ed. Kahn C.R., Weir G.C. – Waverly Company: Lea, Febiger, 1994. – 1068 P.